телефон Казахстан +7 707 177 72 75
телефон Склад в Алматы 329 73 69
Телефон Россия +7 965 706 17 65 Стать партнером компании
vk logo ok logo

Корзина

Корзина пуста.

Изучение белковых компонентов пептидных биорегуляторов природного происхождения

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2003, Том 135, № 1

Изучение белковых компонентов пептидных

биорегуляторов природного происхождения

Г. А. Рыжак, П. А. Некрасов*, О.И. Киселев*, В.Х. Хавинсон

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН;

*НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург

­­______________________________________________________________________________________

Контролю безопасности лекарственных препаратов, в производстве которых используется сырье животного происхождения, должно уделяться особое внимание. При производстве цитомединов и цитаминов используется технология обработки органов и тканей молодых животных, обеспечивающее полное отсутствие  в препаратах инфекционных агентов, протоонкогенов, нуклеиновых кислот и прионных белков, что подтверждено результатами исследования препаратов методами, рекомендованными ВОЗ.

______________________________________________________________________________________

Ключевые слова: прионные белки, протоонкогены, гистохимия, иммуноблотинг

            Природное сырье животного происхождения может включать в себя инфекционные агенты, протоонкогены, нуклеиновые кислоты. В последние годы привлекли к себе внимание прионные инфекции, в этиологии которых определенное место отводится прионам - специфическим инфекционным белкам, относящимся к амилоидам [1, 2, 9]. В связи с этим при производстве препаратов, выделенных из органов и тканей животных, повышенное внимание уделяется проблемам очистки активной субстанции от нежелательных примесей, и в первую очередь - инфекционных агентов.

            В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН разработано 2 класса препаратов природного происхождения - цитомедины (лекарственные препараты) и цитамины (парафармацевтики) [3, 5].

            Целью настоящего исследования был анализ компонентного состава цитомединов и цитаминов для подтверждения отсутствия их контаминации функционально активными протоонкогенами, жизнеспособными вирусами и прионными белками.

Методика исследования

            Технология производства цитомединов и цитаминов обеспечивает максимальную защиту препаратов от попадания инфекционных агентов. Процесс выделения активной субстанции из органов и тканей животных проводится при 3-7оС и рН 3.0 в течение 6 дней. Эти условия достаточны для полной инактивации практически всех вирусов, даже без дополнительных воздействий [8].

            Экспертную оценку контаминации пептидных регуляторов нуклеиновыми кислотами проводили методом фенольно-детергентной экстракции нуклеиновых кислот из препарата с последующим электрофорезом в 1% агарозном геле в трис-ацетатном буфере(окрашивание бромистым этидием) [4].

            С целью подтверждения отсутствия в пептидных регуляторах прионных белков методами            гистохимии, электронной микроскопии, электрофореза и иммуноблотинга изучали сконцентрированные в 200 раз образцы препаратов.

            Для предварительной оценки количества содержащихся в препаратах белков и определения их молекулярной массы использовали электрофорез исследуемого препарата в ПААГ, который проводили по стандартной методике.

            Для первичного скрининга прионных инфекций использовали гистохимический метод, основанный на окрашивании исследуемого препарата конго красным и позволяющий выявить наличие в препарате белков класса амилоида, в том числе и прионов.

            Цитомедины и цитамины являются водорастворимыми препаратами, поэтому образцы фиксировали не на стекле, а в ПААГ. В качестве положительного контроля использовали гистологические препараты амилоидной печени человека.

            Иммуноблотинг проводили с поликлональными антителами к PrP-белкам млекопитающих.

            Для электронно-микроскопического анализа сконцентрированные фракции цитомединов и цитаминов наносили на формвар-углеродные подложки (время сорбции 10 мин) и просматривали под электронным микроскопом "JEM-100S- ("JEOL", х15 000-100 000). Затем подложки с сорбированными препаратами подвергали протеолитической обработке протеиназой К в концентрации 0,2 мг/мл в течение 5, 10 и 20 мин при 37оС, контрастировали и снова просматривали под микроскопом на наличие протеолитически резистентных скрэпи-ассоциированных фибрилл (САФ), в том числе прионов.           

Результаты исследования

            В кортексине и ретиналамине нуклеиновые кислоты не обнаружены, что закономерно с учетом метода  получения препаратов: стадия ультрафильтрационной очистки на полых волокнах с разрешающей способностью 15 кД гарантирует задержание основной массы  нуклеиновых кислот, т.е. частиц размером более 45 нуклеотидов для одноцепочных молекул и более 23 нуклеотидов для двухцепочных молекул. Фрагменты ДНК или РНК не более 45 нуклеотидов не обладают матричной или инфекционной активностью [7, 8].

            Таким образом, представленные экспериментальные данные исключают возможность присутствия в цитомединах и цитаминах жизнеспособных вирусов или функционально активных протоонкогенов.

            Окрашивание на общий белок показало, что кортексин и ретиналамин содержат только короткие полипептиды и полиамины с молекулярной массой, не превышающей 10 кД, что значительно меньше молекулярной массы прионов. Таким образом, высокомолекулярного белка, в том числе прионов, в цитомединах с помощь. электрофореза не выявлено.

            При окрашивании конго красным сконцентрированных фракций цитомединов и цитаминов, фиксированных на ПААГ, не наблюдалось избирательного связывания красителя, в то время как препарат амилоидной печени человека давал яркое избирательное окрашивание конго красным и характерное желто-зеленое свечение амилоидных фибрилл.

            Таким образом, с использованием гистохимического метода в пептидных биорегуляторах не обнаружено амилоидоподобных белковых соединений, в том числе прионов.

            В ходе иммуноблотинга связывания антител с препаратами, выделенными из различных органов и тканей животных, не  наблюдалось. Следовательно нормальный клеточный PrP-белок, безусловно, присутствующий в исходном сырье, эффективно элиминируется в технологическом процессе и в конечном продукте не обнаруживается. Аномальные модификации PrP-белка - прионы - также не выявлены.

            Прямое электронно-микроскопическое выявление прионов в виде САФ в сочетании с протеолизом позволяет обнаружить наличие прионов сразу по двум характерным признакам: протеолитической резистентности и морфологическим особенностям фибриллярных структур, образуемых прионами.

            Некоторые авторы указывают на то, что агрегация отдельных прионных молекул с образованием жгутообразных структур типа САФ может происходить уже после обработки протеиназой К в небольшой концентрации, поэтому в отдельных случаях прионы не обнаруживаются электронно-микроскописеским методом до обработки протеиназой.

            В наших исследованиях ни каких фибриллярных структур, похожих на прионы, в том числе и после протеолиза, выявлено не было.

            Таким образом, диагностическими методами, рекомендованными ВОЗ и утвержденными в России, а также в результате углубленного исследования препаратов с использованием иммуноблотинга и электронной микроскопии в цитомединах и цитаминах не выявлено белковых соединений класса амилоидов, в том числе прионов.

            Результаты исследований позволяют заключить, что технология получения природных биорегуляторов - цитомединов и цитаминов - гарантирует полное отсутствие в препаратах функционально активных протоонкогенов, жизнеспособных вирусов и других инфекционных агентов, в том числе прионных белков.

Литература

            1. Зуев В.А., Завалишин И.А., Ройхель В.М. Прионные болезни человека и животных. М., 1999.

            2. Киселев О.И., Некрасов П.А., Решетникова О.Ю., Воробьев А.А. // Эпидемиол. и инфекц. болезни. 1998. № 1. С. 4-9.

            Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований. СПБ., 1998.

            4. Мазин А.В., Кузнеделов К.Л., Краев А.С. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск, 1990.

            5. Морозов В.Г., Рыжак Г.А., Малинин В.В. Цитамины (биорегуляторы клеточного метаболизма) СПБ., 1999.

            6.Проблемы здравоохранения, связанные со спонгиоформными энцифалопатиями человека и животных: Меморандум совещания ВОЗ // Бюл. ВОЗ. 1992. Т. 70, № 2. С. 24-31.

            7.Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мимс С. Биология вирусов животных. М., 1977. Т. 1. С. 75-77.

            8. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мимс С. Биология вирусов животных. М., 1977. Т. 2. С. 293.

            9. Prusiner S.B. // Semin. Virol. 1996. Vol. 7. P. 157-167.