телефон Казахстан +7 707 177 72 75
телефон Склад в Алматы 329 73 69
Телефон Россия +7 965 706 17 65 Стать партнером компании
vk logo ok logo

Корзина

Корзина пуста.

Индукционная активность пептидов сетчатки

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002. Том 134, № 11

Стр 560-563

БИОГЕРОНТОЛОГИЯ

 

Индукционная активность пептидов сетчатки

В. Х. Хавинсон, В. В, Малинин, С. В. Трофимова, В. Н. Земчихина*

Санкт – Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН; *Институт биологии гена РАН, Москва

Исследовали индукционное влияние ретиналамина – полипептидного препарата, выделенного из сетчатки, на полипотентные клетки эктодермы ранней гаструлы Xenopus laevis.В зависимости от концентрации ретиналамина в эктодерме ранней гаструлы развивается нейральная дифференцировка, включая мозг, сетчатку, пигментный эпителий.

Ключевые слова: ретиналамин, индукция, эктодерма ранней гаструлы, дифференцировка

 

Проблемы возникновения множества клеточных типов в процессе развития организма из оплодотворенной яйцеклетки, т.е. проблемы дифференцировки тканей и обусловливающих ее молекулярных факторов, всегда являлись одними из труднейших и интереснейших в биологии развития. В результате тщательного биохимического анализа H. Tiedemann в 1956 г. Установил, что в основе индукции лежит действие низкомолекулярных белков. Дальнейшие исследования были направлены на их более точную идентификацию. Они показали, что этим веществом является уже известный естественный продукт сосудов взрослых млекопитающих – активин (tgf-β) [10, 12, 14]. Однако это открытие не только завершило многолетние труды, но и указало на определенные проблемы Кроме активина (tgf-β) мезодермальные образования индуцируют многие ростовые факторы. Их действие различается тем, что в отношении осей тела позвоночных одни преимущественно индуцируют ткани верхних уровней, а другие – нижних. Тот же эффект может достигаться применением различных концентраций одного и того же вещества [11].Помимо метода биохимического выделения искомых индукционных факторов, нами был применен метод влияния белками, секретируемыми клетками живых тканей, трансфильтрово [4, 7, 13] или прямо на полипотентную ткань эктодермы ранней гаструлы (ПТЭ), что позволяет наиболее точно исследовать действие тканеспецифичных факторов [6, 7]. Возникает вопрос, насколько присутствие всего набора различных тканеспецифических дифференцировок может быть обусловлено веществами типа активина (tgf-β) и других ростовых факторов, или в этом принимают участие и другие белки.

                В этой связи необходимо отметить появление отдельного класса препаратов – пептидных биорегуляторов, выделенных из различных органов и тканей и содержащих наборы полипептидов с молекулярной массой 1-10 кД [8, 9].При выполнении ряда работ, проведенных на клеточных культурах, установлена тканеспецифичность действия пептидных биорегуляторов [1-3, 5]. Возможно, что набор пептидов, полученный из определенных тканей или органа, имеет в своем составе те пептиды, которые опосредуют такое явление, как аутоиндукцию – поддержание тканевой специфичности в процессе функционирования тканей взрослого организма.

                Целью нашей работы являлось изучение индукционной активности пептидного биорегулятора ретиналамина, выделенного из сетчатки глаза, на ПЭТ шпорцевой лягушки Xenopus laevis в различных концентрациях.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

                В качестве экспериментального объекта использовали зародыши шпоровых лягушек X. Laevis. Икру получали  при помощи искусственной стимуляции самца и самки гонадотропином. Для этого из имеющегося стада лягушек отбирали пары, которые в течение последних 6 мес давали полноценную икру (количество живых икринок не менее 70%). Затем отобранным самцу и самке вводили в спинные лимфатические мешки по 200 и 400 ед. гонадотропина соответственно.

                Зародышей на необходимой стадии развития стерилизовали в 70% спиртовом растворе в течение 30 с, затем промывали 2 раза в стерильной воде и помещали в стерильную чашку Петри диаметром 3,5 см со стерильным солевым раствором для амфибий Ниу-Твитти с добавлением антибиотиков. После стерилизации с зародышей снимали все оболочки и приступали к выделению необходимых для опытов участков тканей.

 

 

Распределение % по типам тканей индуцированных ретиналамином в ПЭТ ранней гаструлы

Показатель

 

Концентрация ретиналамина, нг/мл

0 контроль

200

100

50

20

10

2

Число исследованных/учтенных при анализе культур

20/20

90/64

90/85

90/60

90/40

90/80

90/70

Тип ткани          атипичный эпидермис

100

100

90

90

100

83

92

                            эпидермис

-

39

-

15

40

42

38

                            меланофоры

-

-

40

12

20

10

8

                            нервная

-

-

12

-

-

33

15

                            мозг

-

-

-

12

-

8

8

                            сетчатка

-

-

-

-

-

3

-

                            пигментный эпителий

-

-

-

-

-

1

-

                                                                                                                                               

 

Рис. 1 Культура эктодермы ранней гаструлы, развившейся через 5 сут  после воздействия на нее ретиналамина в концентрации 2 нг/мл, время экспозиции 1 ч. Стрелкой указан мозг.

 

                В качестве тест-системы (полипотентной ткани, способной под воздействием того или иного индуцирующего агента приступить к определенной дифференцировке) использовали эктодерму ранней гаструлы X. Laevis. Из крыши полости дробления ранних гаструл X. Laevis на стадии 10.5 вырезали участки, не захватывая краевую эктодерму, которая благодаря тангенциальному влиянию окружающих ее частей могла быть частично проиндуцирована. Эти участки помещали в испытуемые растворы и выдерживали в течение 1 ч, пока они не сворачивались в замкнутые пузырьки. Далее эти свернутые пузырьки переносили в стерильный раствор Ниу-Твитти для амфибий, содержащий антибиотики, и культивировали в последнем 4-5 сут при 20˚С в инкубаторе. В качестве контроля в стерильном солевом растворе Ниу-Твитти инкубировали крыши полости дробления ранних гаструл X. Laevis на стадии 10.5 также в течение 4-5 сут. Затем эксплантаты фиксировали жидкостью Буэна. Проводили через ряд спиртов, готовили срезы толщиной 5 мкм и окрашивали азокармином  с докраской по Мэллори.

                Исследовали стандартный раствор ретиналамина в концентрациях 200, 100, 50, 20, 10 и 2 нг/мл. С каждой концентрацией ставили по 30 культур, в качестве контроля – 20 культур. В контрольных культурах развился лишь атипичный эпидермис.

                Поскольку в работе необходимо было учесть зависимость восприятия индукционного сигнала полипотентными клетками от геометрии ткани в момент восприятия, в 1 серии было использовано несколько схем постановки опыта.

                В первом варианте эктодерму ранней гаструлы стадии 10.5 помещали в испытуемый раствор активной стороной вверх, где она постепенно сворачивалась в течение 1 ч; в двух других вариантах эктодерму, уложенную активной стороной на фильтр или наверх, прижимали грузом, что не давало ей возможности свернуться ранее 1 ч экспозиции. Далее свернувшуюся или не свернувшуюся эктодерму (после снятия груза) помещали в физиологический раствор Ниу-Твитти для амфибий с антибиотиками и культивировали. Как указано выше.

                Обработка результатов 1 серии опытов показала, что геометрия ткани в момент восприятия индукционного сигнала не влияет на возникающую дифференцировку ткани. Поэтому следующие 2 серии опытов ставили со свернувшейся эктодермой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

                Под действием ретиналамина отмечена нейральная индукция, включая мозг, сетчатку, пигментный эпителий (таблица; рис. 1; рис. 2, а) Процент проиндуцированных эктодерм (около 12-15) невысок, но специфичен для пептидов.

                При воздействии ретиналамина в концентрации 50 нг/мл в ряде случаев не только развился мозг, но, по всей видимости, в его составе возникал и эпифиз, однако данное предположение требует подтверждения специфическими иммунохимическими методами исследования. После инкубации с ретиналамином в концентрации 10 нг/мл лишь в 2 культурах из 80, взятых в исследование, развилась сетчатка, и в 1 – пигментный эпителий (рис. 2, б).

               

 

Рис. 2. Гистологические срезы (5мкм) культуры эктодермы ранней гаструлы, развившейся через 5 сут после воздействия на нее ретиналамина в концентрации 2 (а) и 10 нг/мл (б), время экспозиции 1 ч, х250.

АЭ – атипичный эпидермис, ЭП – эпидермис, М – мозг, С – сетчатка, ПЭ – пигментный эпидермис.

 

Сопоставляя данные наших исследований  с результатами работ, в которых изучалось влияние пептидных биорегуляторов на клеточные культуры, необходимо отметить, что при влиянии индукционных белков в концентрациях 10 нг/мл и ниже индукционный ответ практически не наблюдался. При исследовании ретиналамина оказались активными концентрации 50, 10 и 2 нг/мл, т.е. имеет место непрямая зависимость индукционного эффекта от концентрации индуцирующего фактора. Причем тканеспецифическая дифференцировка отмечалась при воздействии ретиналамина в минимальных исследуемых концентрациях.

Таким образом, воздействие органных пептидов на полипотентные и стволовые клетки может рассматриваться как один из путей направленной тканеспецифической дифференцировки.

 

Литература

  1. Анисимов В. Н., Хавинсон В. Х., Алимова И. Н. и др. //Бюл. Экспер. Биол. 2002 Т. 133. № 2. С. 199-202.
  2. Анисимов С. В., Бохелер К. Р., Хавинсон В. Х, Анисимов В. Н. // Там же № 3. С. 340-347.
  3. Бродский В. Я., Хавинсон В. Х., Золотарев Ю. А. и др. //Изв. РАН. Сер. Биол. 2001 № 5. С. 517-521.
  4. Голубева О. Н., Лопашов Г. В. //Докл. РАН. 1996. Т. 348 № 4. С. 560-563.
  5. Гончаров Н. Д., Хавинсон В. Х., Лапин Ю. А. // Бюл. Экспер. Биол. 2001. Т. 131, № 4. С. 466-468.
  6. Земчихина В. Н., Костюк Р. В., Новикова З. В., Лопашов Г. В. // Генетика. 2000. Т. 36, № 11. С. 1546-1552.
  7. Лопашов Г. В., Земчихина В. Н. // Успехи соврем. Биол. 2000. Т. № 6. С. 540-549.
  8. Хавинсон В. Х. //Бюл. Экспер. Биол. 2001. Т. 132, № 8. С. 228-229.
  9. Хавинсон В. Х., Малинин В. В., Чалисова Н. И., Григорьев Е. И. // Успехи геронтол. 2002. Вып. 9. С. 95-100.
  10. Asashima M., Nokano H., Shimada R. et al. //Roux Arch. Devel. Biol. 1990/ Vol/ 198. P. 330-335.
  11. Asashima M. // Dev. Growth Differ. 1994. Vol. 36. H. 343-356.
  12. Chertov O. Yu., Krasnoset’skii A. L., Bogdanov M. E., Hoperskaya O. A. // Biomed. Sci. 1990. Vol. 1. P. 499-506.
  13. Lopashov G. V., Golubeva O. N., Zviadadze K. G. // Differentiation. 1997. Vol. 61. P. 237-242.
  14. Snith J. C., Price B. J. M., van Nimmen K., Huylebrook D. // Nature. 1990. Vol. 345. P. 729-731.